METODI E STRUMENTI

L’operazione del prelievo del campione è una delle più delicate dell’intero processo analitico. Se questo è alterato, mal prelevato o comunque non rappresentativo, l’analisi non è attendibile, con gravi conseguenze per quanto riguarda la certificazione legale o almeno ufficiale.

Il campionamento viene descritto dal metodo ufficiale IRSA-CNR numero 1030, pp. 75 - 64.

I campioni di acqua, raccolti dalle quattro stazioni selezionate (Fitodepuratore, Moletto, Porto del Grifone e Piscina Porcinai), sono stati immessi in bottiglie inerti di plastica (polietilene) da 1,5 litri e, per l’analisi microbiologica, in contenitori sterili. I recipienti, previa avvinatura con l’acqua in esame, sono stati riempiti sino all’orlo per evitare la presenza di bolle d’aria ed eventuali contaminazioni.

Dopo tre ore dal prelievo le bottiglie per l’analisi microbiologica sono state trasferite in frigorifero e, entro le 48 ore, è stata effettuata l’analisi. I contenitori di polietilene per l’analisi chimico-fisica sono state conservate al buio e, a seconda degli ioni ricercati, conservati a 4 °C e/o acidificati a pH < 2, rispettando i tempi massimi tra il campionamento e l’analisi.

In bottiglie di vetro apposite (con tappo a becco di clarino) è stata prelevata l’acqua utilizzata per il BOD₅. Anche durante questi prelievi - e a maggior ragione - non bisogna far rimanere bolle d’aria dentro le bottiglie, perché l’analisi ne risulterebbe compromessa. Ricoperte di carta stagnola (o colorate di nero), per non far entrare la luce - la quale consentirebbe la fotosintesi con un’ulteriore produzione di ossigeno - le bottiglie sono state mantenute al freddo per un massimo di 24 ore. Non è stato necessario portare un frigorifero portatile perché le temperature della giornata non lo rendevano necessario.

Anche ai fini della determinazione del COD si sono eseguiti i prelievi su bottiglie di vetro, con la stessa modalità del BOD, ma senza inoculo e conservando i campioni a circa 4°C sino al momento dell’analisi. È consigliabile che l’analisi sia fatta al più presto possibile dopo il campionamento. Se il campione non può essere analizzato subito dopo il prelievo, al fine di evitare eventuali perdite conseguenti ad ossidazione biologica delle sostanze organiche, questo deve essere preservato per acidificazione fino a pH 1-2 con acido solforico e l’analisi eseguita entro una settimana.

Per "analisi microbiologica delle acque" si intende l'individuazione dei microrganismi presenti in esse, generalmente congiunta alla loro valutazione quantitativa. Ciò si ottiene mediante tecniche analitiche basate sulla riproduzione dei microrganismi considerati espressione del grado di inquinamento, cui le acque sono soggette, su terreni colturali idonei alla loro crescita. Nel caso particolare delle acque superficiali attraverso l’analisi microbiologica se ne definisce la qualità.

L’esame microbiologico delle acque in generale e delle acque superficiali in particolare, si basa essenzialmente sulla possibilità di coltivare su idonei terreni, e in idonee condizioni colturali, i batteri contenuti nell’acqua in esame, utilizzando particolari metodologie finalizzate alla individuazione di specie o di gruppi microbici che si ritengono significativi per la formulazione di un giudizio igienico-sanitario o di qualità delle acque in esame.

Di seguito viene riportata la metodica di tipo tossicologico e batteriologico utilizzata per il monitoraggio dei punti di prelievo.

Materiali fondamentali per una analisi microbiologica: terreno agar (terreno formato da nutrienti e componenti necessari per la crescita dei microrganismi). Questo terreno è solido a temperature inferiori ai 40 gradi e liquido al di sopra; piastra (ovviamente sterile) dove depositare il campione; pipetta sterile e becco bunsen che serve a sterilizzare l’aria della cappa in cui avviene l’analisi.

Prodedimento:

Su due piastre sterili si introduce 1 ml d’acqua da analizzare insieme a brodo “agarizzato” (Plate Count Agar). Fatto ciò si pongono in incubazione, rispettivamente a 20 °C per 72 ore la prima e a 37 °C per 48 ore la seconda. L’uso delle due diverse temperature consente, entro certi limiti, la differenziazione tra le specie telluriche (20 °C) e quelle di origine animale (36 °C).

Al termine si osserva così quante colonie di microrganismi sono presenti nelle piastre: l’acqua per essere potabile deve avere a 37°C un numero di colonie inferiore a 10, e a 20°C un numero di colonie inferiore a 100.

Si verifica successivamente se tra i microrganismi sono presenti tipologie coliformi, in quanto la loro presenza è indice di non potabilità dell’acqua.

Per far ciò si inoculano una serie di 5 tubi contenenti brodo lattosato con 10 ml di campione per ciascun tubo; questi, successivamente, vengono incubati in un termostato per 48 ore a 37°C. Devono essere considerati positivi tutti i contenitori che presentano torbidità e nei quali si sia formato gas, anche in piccole quantità, evidenziato dalla salita della campanella di Duhram posta all’interno della provetta.

Lo sviluppo microbico con produzione di gas non costituisce indizio certo della presenza di coliformi, perché altri microrganismi pos­sono condividere la capacità di fermentare il lattosio. Pertanto la prova con Brodo Lattosato è una prova presuntiva che deve essere seguita da quella di conferma secondo:

1) la metodica del «Most Probable Number»,

2) la metodica della filtrazione per membrana (MF).

Seguendo la prima metodica, per ogni campione positivo - con ansa sterile - se ne prelevano alcune gocce e si inoculano in una serie di 3 tubi contenenti una campanella di Duhram. Nello specifico si fanno in sequenza tre analisi:

a) per avere la certezza della presenza dei coliformi, ad uno dei tre tubi così preparati si immette un brodo specifico, chiamato verde brillante, e si mette a 37°C per 24 - 48 ore;

b) se l’esame risulta positivo si ripete l’analisi, sempre con verde brillante, ma l’incubazione deve avvenire a 44°C per 24 ore: questo per avere la certezza della presenza dei coliformi fecali.

In entrambe le prove sono considerati positivi i tubi nei quali si sia for­mato gas anche in piccole quantità. Sulla base della positività su tale terreno si consulta la tabella seguente e si riporta il valore come M.P.N. in 100 ml di campione.

                                

c) Se anche questo esame risulta positivo si ripete nuovamente l’analisi con la stessa procedura, aggiungendo però come brodo solo dell’acqua peptonata. Dopo aver incubato per 48 ore a 44 °C si aggiunge una goccia di reattivo di Kovacs: la formazione di un anello rosso segnalerà la presenza di un particolare coliforme chiamato Escherichia Coli.

L’Escherichia Coli è un batterio, normale ospite dell'intestino di animali a sangue caldo, quindi anche dell'uomo. È la sola specie predominante tra la flora batterica aerobia-anaerobia facoltativa che si rivela nell’intestino crasso. Essendo un componente normale ed esclusivo della flora batterica del tratto enterico, la sua presenza in acqua è indice sicuro di contaminazione fecale. E’ quindi un parametro importante per la potabilità dell’acqua.

Il metodo MF (FILTRAZIONE SU MEMBRANA) è più usato dell’MPN, per la sua praticità. Per tale metodo è stata sviluppata una membrana filtrante in grado di filtrare batteri dall'acqua e da altri materiali. Dopo aver posto la membrana, con pori di dimensioni di circa 0.45 μ, sull'apposito imbuto per filtrazione, collegato alla pompa a vuoto, si filtrano volumi variabili di campione, in genere da 20 ml a 1 ml in relazione al grado di contaminazione stimato.

La tecnica è semplice e veloce: i batteri rimangono intrappolati sulla superficie del filtro. Dopo la filtrazione ogni membrana viene posizionata in una piastra contenente uno specifico terreno di coltura che permette la crescita e la differenziazione dei batteri ricercati. Dopo l’incubazione è possibile contare le colonie.

Per calcolare il numero di batteri in 100 ml di campione si usa la seguente formula:

n°. colonie

────────── X 100

ml campione

Per i coliformi totali il terreno da usare è l’m Endo Agar LES. Questo si trova in commercio in forma disidratata, e si pre­para secondo le istruzioni della ditta produttrice, ricor­dando che devono essere aggiunti 20 ml di alcool etilico in 1 litro di soluzione. Sono considerate positive solo le colonie rosso scuro e/o con lucentezza metallica verde-dorata cresciute A 37 °C per 24 ore. La lucentezza può interessare l’intera colonia o essere limitata nella zona centrale del perimetro.

Per i coliformi fecali il terreno di coltura da usare è l’mFC Agar. Questo si trova in commercio in forma disidratata e si pre­para secondo le istruzioni della ditta produttrice, ricor­dando che a 52 g di polvere in 1 l di acqua distillata, vanno aggiunti 10 ml di una soluzione di acido rosolico all’1 % in idrossido di sodio 0,2 N. La soluzione di acido rosolico può essere utilizzata anche a maggiori diluizio­ni. Non si sterilizza in autoclave. Il terreno può essere conservato ed utilizzato entro quattro giorni dalla preparazione. Sono considerate positive solo le colonie blu cresciute a 44 °C per 24 ore.

Per gli streptococchi fecali, infine, il terreno di coltura da usare è l’ KF Streptococcus Agar. Questo si trova in commercio in forma disi­dratata, una volta disciolto si sterilizza in autoclave a 121 °C per 15 minuti. Si lascia poi raffreddare fino a 50 °C e poi vi si aggiunge asetticamente una soluzione acquosa sterile all’1% di 2, 3, 5, trifenil tetrazolio clo­ruro (TTC) in ragione di 1 ml/100 ml di terreno. Sono considerate positive solo le colonie rosse di 0,3-2 mm di dia­metro cresciute a 36 °C per 48 ore.

CAMPIONAMENTO DELLA FAUNA ACQUATICA:

Il campionamento faunistico deve essere eseguito dopo le eventuali analisi chimico-fisiche in situ e i prelievi d’acqua. Ciò si rende necessario per non compromettere le analisi e i risultati chimici a causa degli intorbidamenti provocati dai necessari dragaggi.

L’esecuzione di in buon campionamento prevede di analizzare le stazioni suddividendole in metri quadrati; grazie a questo metodo possiamo avere una migliore ripartizione delle zone e della fauna tipica.

Per raccogliere gli insetti e gli altri organismi acquatici si usano particolari retini che dragano le zone di fondo e altri più adatti alla superficie dell’acqua. Questi retini possono essere di varia grandezza e forma; per esempio per dragare il pelo dell’acqua si usano retini aventi coni con dentro una specie di bicchiere e caratterizzati di una rete molta fitta. Oltre all’utilizzo di retini è bene ispezionare la vegetazione sommersa, come per esempio ninfee, muschi e cortecce; anche i canneti, se presenti, devono essere controllati per rintracciarne la fauna caratteristica, come ad esempio le spugne d’acqua dolce. Infine una particolare attenzione è bene porla alle eventuali pietre presenti nella stazione, perché rappresentano l’habitat di alcuni insetti.

METODO UTILIZZATO:

Dopo aver prelevato nelle stazioni le varie specie di insetti o organismi, il materiale raccolto deve essere osservato con gli stereomicroscopi o binoculari, che consentono un ingrandimento da 10 a 40 volte. Questo strumento permette la individuazione delle caratteristiche dell’insetto non distinguibili a occhio nudo. Per una corretta diagnosi specifica si analizzano prevalentemente adulti; alcuni di essi, come ad esempio i Tricotteri, sono identificabili solo osservando le armature genitali dell’insetto.

Per una prima diagnosi sistematica, per lo più limitata all’individuazione degli Ordini e delle Famiglie, i reperti raccolti e mantenuti in vita vengono posti su piastre e osservati con il suddetto binoculare. La consultazione di manuali specializzati completa questa prima indagine.

I materiali campionati dovranno poi essere fissati in alcol etilico al 70%, per consentirne il mantenimento ed eventuali approfondimenti, oltre che per essere documenti fotograficamente.